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細胞毒試驗的幾種方法
點擊次數(shù)：5788 日期：2014/1/11 14:05:31
細胞毒試驗實在組織培養(yǎng)中研究淋巴細胞、抗體或抗體依賴性淋巴細胞殺傷靶細胞的一種技術(shù),也是在體外研究特異性細胞免疫比較可靠和靈敏的方法,目前微量細胞毒試驗是應用*廣的一種方法.
（一）淋巴細胞對腫瘤細胞的細胞毒試驗方法：
1) 腫瘤細胞培養(yǎng)物制成懸液,并稀釋至需要的細胞濃度.
2) 于微量試驗班的小孔內(nèi)分別接種0.2ml腫瘤細胞（內(nèi)含5×102）個細胞,37℃培育24h.
3) 細胞貼壁后,輕輕輕去培養(yǎng)基,加1mlPBS洗滌,輕去洗滌液及未貼壁細胞.
4) 向小孔分別加入0.2ml不同濃度的淋巴細胞（分別含有5×105個細胞,5×104個細胞,5×103個細胞）,使淋巴細胞與癌細胞之比依次為1000：1、100：1、10：1.
5) 45min后加0.1ml5%胎牛血清,37℃繼續(xù)培養(yǎng)2-3天.
6) 2%臺盼藍染色,翻轉(zhuǎn)微量試驗班,計數(shù)活存的腫瘤細胞,并設正常人淋巴細胞代替腫瘤患者淋巴細胞作對照,每份需同時做3個復孔,分別檢查各孔中存活活細胞數(shù),按下列公式計算細胞毒率,并做t檢驗.
（二） 抗體加補體的細胞毒試驗方法：
此法是組織相容性抗原（HLA）檢查技術(shù)中*常用的一種方法.也稱微量淋巴細胞毒試驗.人體的組織相容性抗原存在于淋巴細胞膜的表面,從供者與受者的血液分離淋巴細胞作為靶細胞,以各種定型單價抗血清與家兔血清補體作為效應系統(tǒng).如果淋巴細胞表面具有與抗血清相對應的抗原,則淋巴細胞就會受損傷或致死而被臺盼藍染色.
1、 材料：
a.淋巴細胞
b. 血清.小牛血清（56℃滅活30min）
c.待測血清.收集多產(chǎn)婦分娩時的胎盤剝離后的血,分出血清,疊氮納防腐,4℃保存.
d.已知陽性對照血清.用上海市中心血站制備的馬抗人淋巴細胞血清（ALS）,同時做1：3稀釋.
e.補體.新鮮家兔混合血清,分裝小試管,保存于-20℃.
2、 操作步驟：
a.在塑料試驗盒內(nèi)加入醫(yī)用液體石蠟油20ml,放進一塊52孔微量玻璃試驗班,使板沉至盒底.
b.用0.25ml的微量定量加液器分別加入待測血清和陽性對照血清2-2ul/孔,陰性對照用Hanks液代之.加樣針尖應磨平.
c.用同法每孔內(nèi)加入待測的淋巴細胞2-3ul,應先加陰性對照和補體對照孔,然后加待測孔,*后加陽性血清對照孔,加后輕搖使其混勻,置室溫作用1h.
d.每孔加入兔補體5-7ul（按加淋巴細胞順序加入）,置37℃培育45min（或室溫作用1h）.
e.每孔加入2%臺盼藍等滲液3-5ul室溫中靜置20min,吸去藍色上清.
f.普通顯微鏡檢查,記錄每孔中死細胞（著色細胞）數(shù).
死細胞.體積稍大,著藍色,無折光性.
活細胞.大小正常,未著色,較透亮.
判斷標準（每次實驗,需做3-6個復本）.
其中著色細胞：《=20%為陰性, 20%--50%為弱陽性, 50%--70%為陽性, 》=70%為強陽性.
（三）ADCC試驗：
抗體依賴細胞介導細胞毒作用用來檢查K細胞的Fc受體,該細胞結(jié)合抗體殺傷靶細胞的作用是非特異性的,故稱為抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用(ADCC).
（四） NK細胞毒試驗之51Cr稀放法：
1) 效應細胞的制備
用常規(guī)的Fico11分離法分離外周血中的耽擱核細胞,經(jīng)玻璃瓶37℃貼壁2h,以除去單核-巨噬細胞,計數(shù)活細胞數(shù),使細胞濃度為5×106個/ml,細胞存活率為95%以上（小鼠可用鼠脾細胞）.
2) 靶細胞制備
取培養(yǎng)24-48h的K562細胞,培養(yǎng)基洗一次,用營養(yǎng)液配成4×106個/0.5ml,加3.7MBq 51Cr,37℃水浴90min隔15min搖勻一次,然后洗滌3次,除去游離的51Cr,計數(shù)活細胞,稀釋細胞數(shù)達1×105個/ml.
3) NK細胞活性測定
用4h短程稀放法,自然殺傷組效應細胞/靶細胞（50：1）各0.2ml,自然稀放組以營養(yǎng)液代替效應細胞,*大稀放組以2%SDS代替效應細胞,分別置37℃接觸4h,然后各管加冷Hanks液0.6ml終止反應,離心（1000r/min）10min,吸上清0.5ml,用γ計數(shù)器測放射性.
（五）NK細胞毒試驗之3H-TdR法：
取培養(yǎng)24-48h的K562靶細胞,稀釋至5 × 104個/ml,效應細胞為人外周血單個核細胞,制成5 × 106個/ml細胞懸液,加入微板中,每孔加入靶細胞與效應細胞各0.1ml,靶細胞自然摻入對照組僅加入靶細胞懸液0.1ml,用RPMI 1640培養(yǎng)基0.1ml代替效應細胞,每組均設3個復孔,加入細胞懸液后,每孔立即加入3H-TdR37kBq,然后置于37℃、5%CO2中培養(yǎng)20h,收集細胞于纖維濾紙上,用γ計數(shù)器測定cpm,用特異抑制百分率（Pi）表示NK細胞活化.
（六）NKCF檢測（MTT法）：
培養(yǎng)3天的K562細胞經(jīng)完全培養(yǎng)基洗滌1次后配成2.5×105個/ml細胞懸液,在微孔培養(yǎng)板上加入50ul/孔,再加入含NKCF標本50ul/孔,標本不同稀釋度為1：2、1：4、1：8、1：16、、、、、、,陰性對照為無NKCF的培養(yǎng)基,陽性對照為蒸餾水,每份標本設3個復孔取其平均值,另設1個無細胞空白對照.置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,加MTT厚的過程與活細胞檢測基本相同.按公式計算各稀釋度的NKCF值.
此外還有臺盼藍排除法,通過計算細胞死亡率（或存活率）來表示NK細胞的殺傷活性,方法簡便易行,但有客觀因素影響,對NK細胞的殺傷效應也可采用MTT法.
（七）LAK細胞毒試驗之125I釋放法：
（1）LAK細胞的制備 經(jīng)乙醚麻醉后,無菌取鼠脾臟,淋巴細胞經(jīng)擠壓后,用4層紗布過濾,經(jīng)3次離心洗滌,制成細胞懸液,將濃度調(diào)至107個/ml,加IL-2制品1ml,置于37℃、5%CO2孵育5天,存活的淋巴細胞可作為LAK細胞使用.
（2）LAK細胞體外毒活性測定 用125I脫氧尿嘧啶核苷標記WBT-2M纖維肉瘤靶細胞,每106個細胞加125I尿嘧啶核苷148kBq,37℃靜置培養(yǎng)14h,接著用Hanks液離心3次,充分洗滌,然后分別與效應細胞置微量培養(yǎng)板中共同孵育6h,吸取上清,用γ計算器測定同位素的釋放量,按公式計算其細胞毒的百分率.
（八）CTL的細胞毒試驗：
取淋巴細胞1 × 106個/ml,經(jīng)ConA 3ug/ml刺激培養(yǎng)5天獲效應CTL,靶細胞為用125I-UdR標記的肥大細胞瘤P815細胞或者為K562細胞,其方法為每孔加入50ulCTL,70ul含1 × 104個125I-UdR標記的P815細胞及30ul 1/25稀釋的PHA,微孔經(jīng)1200r/min離心5min后,37℃培養(yǎng)3.5h后取出,再加入0.5%胰蛋白酶50ul再培養(yǎng)30min后以1200r/min離心,取每孔中上清100ul加入小玻璃管中,將每孔中的細胞收獲于玻璃纖維質(zhì)上,用γ計算器分別測上清及細胞中cpm值,按公式計算殺傷效應.
（一）淋巴細胞對腫瘤細胞的細胞毒試驗方法：
1) 腫瘤細胞培養(yǎng)物制成懸液,并稀釋至需要的細胞濃度.
2) 于微量試驗班的小孔內(nèi)分別接種0.2ml腫瘤細胞（內(nèi)含5×102）個細胞,37℃培育24h.
3) 細胞貼壁后,輕輕輕去培養(yǎng)基,加1mlPBS洗滌,輕去洗滌液及未貼壁細胞.
4) 向小孔分別加入0.2ml不同濃度的淋巴細胞（分別含有5×105個細胞,5×104個細胞,5×103個細胞）,使淋巴細胞與癌細胞之比依次為1000：1、100：1、10：1.
5) 45min后加0.1ml5%胎牛血清,37℃繼續(xù)培養(yǎng)2-3天.
6) 2%臺盼藍染色,翻轉(zhuǎn)微量試驗班,計數(shù)活存的腫瘤細胞,并設正常人淋巴細胞代替腫瘤患者淋巴細胞作對照,每份需同時做3個復孔,分別檢查各孔中存活活細胞數(shù),按下列公式計算細胞毒率,并做t檢驗.
（二） 抗體加補體的細胞毒試驗方法：
此法是組織相容性抗原（HLA）檢查技術(shù)中*常用的一種方法.也稱微量淋巴細胞毒試驗.人體的組織相容性抗原存在于淋巴細胞膜的表面,從供者與受者的血液分離淋巴細胞作為靶細胞,以各種定型單價抗血清與家兔血清補體作為效應系統(tǒng).如果淋巴細胞表面具有與抗血清相對應的抗原,則淋巴細胞就會受損傷或致死而被臺盼藍染色.
1、 材料：
a.淋巴細胞
b. 血清.小牛血清（56℃滅活30min）
c.待測血清.收集多產(chǎn)婦分娩時的胎盤剝離后的血,分出血清,疊氮納防腐,4℃保存.
d.已知陽性對照血清.用上海市中心血站制備的馬抗人淋巴細胞血清（ALS）,同時做1：3稀釋.
e.補體.新鮮家兔混合血清,分裝小試管,保存于-20℃.
2、 操作步驟：
a.在塑料試驗盒內(nèi)加入醫(yī)用液體石蠟油20ml,放進一塊52孔微量玻璃試驗班,使板沉至盒底.
b.用0.25ml的微量定量加液器分別加入待測血清和陽性對照血清2-2ul/孔,陰性對照用Hanks液代之.加樣針尖應磨平.
c.用同法每孔內(nèi)加入待測的淋巴細胞2-3ul,應先加陰性對照和補體對照孔,然后加待測孔,*后加陽性血清對照孔,加后輕搖使其混勻,置室溫作用1h.
d.每孔加入兔補體5-7ul（按加淋巴細胞順序加入）,置37℃培育45min（或室溫作用1h）.
e.每孔加入2%臺盼藍等滲液3-5ul室溫中靜置20min,吸去藍色上清.
f.普通顯微鏡檢查,記錄每孔中死細胞（著色細胞）數(shù).
死細胞.體積稍大,著藍色,無折光性.
活細胞.大小正常,未著色,較透亮.
判斷標準（每次實驗,需做3-6個復本）.
其中著色細胞：《=20%為陰性, 20%--50%為弱陽性, 50%--70%為陽性, 》=70%為強陽性.
（三）ADCC試驗：
抗體依賴細胞介導細胞毒作用用來檢查K細胞的Fc受體,該細胞結(jié)合抗體殺傷靶細胞的作用是非特異性的,故稱為抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用(ADCC).
（四） NK細胞毒試驗之51Cr稀放法：
1) 效應細胞的制備
用常規(guī)的Fico11分離法分離外周血中的耽擱核細胞,經(jīng)玻璃瓶37℃貼壁2h,以除去單核-巨噬細胞,計數(shù)活細胞數(shù),使細胞濃度為5×106個/ml,細胞存活率為95%以上（小鼠可用鼠脾細胞）.
2) 靶細胞制備
取培養(yǎng)24-48h的K562細胞,培養(yǎng)基洗一次,用營養(yǎng)液配成4×106個/0.5ml,加3.7MBq 51Cr,37℃水浴90min隔15min搖勻一次,然后洗滌3次,除去游離的51Cr,計數(shù)活細胞,稀釋細胞數(shù)達1×105個/ml.
3) NK細胞活性測定
用4h短程稀放法,自然殺傷組效應細胞/靶細胞（50：1）各0.2ml,自然稀放組以營養(yǎng)液代替效應細胞,*大稀放組以2%SDS代替效應細胞,分別置37℃接觸4h,然后各管加冷Hanks液0.6ml終止反應,離心（1000r/min）10min,吸上清0.5ml,用γ計數(shù)器測放射性.
（五）NK細胞毒試驗之3H-TdR法：
取培養(yǎng)24-48h的K562靶細胞,稀釋至5 × 104個/ml,效應細胞為人外周血單個核細胞,制成5 × 106個/ml細胞懸液,加入微板中,每孔加入靶細胞與效應細胞各0.1ml,靶細胞自然摻入對照組僅加入靶細胞懸液0.1ml,用RPMI 1640培養(yǎng)基0.1ml代替效應細胞,每組均設3個復孔,加入細胞懸液后,每孔立即加入3H-TdR37kBq,然后置于37℃、5%CO2中培養(yǎng)20h,收集細胞于纖維濾紙上,用γ計數(shù)器測定cpm,用特異抑制百分率（Pi）表示NK細胞活化.
（六）NKCF檢測（MTT法）：
培養(yǎng)3天的K562細胞經(jīng)完全培養(yǎng)基洗滌1次后配成2.5×105個/ml細胞懸液,在微孔培養(yǎng)板上加入50ul/孔,再加入含NKCF標本50ul/孔,標本不同稀釋度為1：2、1：4、1：8、1：16、、、、、、,陰性對照為無NKCF的培養(yǎng)基,陽性對照為蒸餾水,每份標本設3個復孔取其平均值,另設1個無細胞空白對照.置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,加MTT厚的過程與活細胞檢測基本相同.按公式計算各稀釋度的NKCF值.
此外還有臺盼藍排除法,通過計算細胞死亡率（或存活率）來表示NK細胞的殺傷活性,方法簡便易行,但有客觀因素影響,對NK細胞的殺傷效應也可采用MTT法.
（七）LAK細胞毒試驗之125I釋放法：
（1）LAK細胞的制備 經(jīng)乙醚麻醉后,無菌取鼠脾臟,淋巴細胞經(jīng)擠壓后,用4層紗布過濾,經(jīng)3次離心洗滌,制成細胞懸液,將濃度調(diào)至107個/ml,加IL-2制品1ml,置于37℃、5%CO2孵育5天,存活的淋巴細胞可作為LAK細胞使用.
（2）LAK細胞體外毒活性測定 用125I脫氧尿嘧啶核苷標記WBT-2M纖維肉瘤靶細胞,每106個細胞加125I尿嘧啶核苷148kBq,37℃靜置培養(yǎng)14h,接著用Hanks液離心3次,充分洗滌,然后分別與效應細胞置微量培養(yǎng)板中共同孵育6h,吸取上清,用γ計算器測定同位素的釋放量,按公式計算其細胞毒的百分率.
（八）CTL的細胞毒試驗：
取淋巴細胞1 × 106個/ml,經(jīng)ConA 3ug/ml刺激培養(yǎng)5天獲效應CTL,靶細胞為用125I-UdR標記的肥大細胞瘤P815細胞或者為K562細胞,其方法為每孔加入50ulCTL,70ul含1 × 104個125I-UdR標記的P815細胞及30ul 1/25稀釋的PHA,微孔經(jīng)1200r/min離心5min后,37℃培養(yǎng)3.5h后取出,再加入0.5%胰蛋白酶50ul再培養(yǎng)30min后以1200r/min離心,取每孔中上清100ul加入小玻璃管中,將每孔中的細胞收獲于玻璃纖維質(zhì)上,用γ計算器分別測上清及細胞中cpm值,按公式計算殺傷效應.
